Korona / Vpogled_v_znanje_o_koronavirusu

Vpogled v znanje o koronavirusu za slovensko javnost

Dušan Turk, Boris Turk, Odsek za biokemijo in molekularno in strukturno biologijo
Boris Rogelj, Janko Kos, Odsek za biotehnologijo
Igor Križaj, Odsek za molekularne in biomedicinske znanosti

Grafični prikaz in razlaga strukture koronavirusa SARS-CoV-2 -video

Virusi so stalni spremljevalci življenja, zelo verjetno od njegovih začetkov naprej. V nasprotju s celicami, obdanimi s celično steno oziroma membrano, ki imajo svoj metabolizem, je življenjski cikel virusa vezan na živo celico gostitelja. Kadar je virus v obliki delca, nima lastnega metabolizma in lahko zato zelo dolgo preždi v okolju brez hrane (energije) ali pa se celo potuhne v gostiteljskem organizmu, kot na primer virus HIV, ki se manifestira kot bolezen AIDS. Virusni delec lahko primerjamo s semenom, ki mora najprej najti plodna tla, da lahko začne rasti. Virusni substrat, iz katerega se hrani, je celica, vendar ne vsaka. Primerne so samo tiste celice, v katere lahko virus vstopi, saj dejansko »zaživi« šele takrat, ko vstopi oziroma vdre v celico. Da lahko vstopi, si pomaga z razpoznavnim mestom oziroma proteinom, ki se je na površini celice in se imenuje receptor. Vsak virus oziroma skupina virusov je tako usmerjena na specifične receptorje. Prenos med vrstami postane mogoč takrat, kadar je interakcija z receptorjem druge vrste dovolj močna, da omogoča vdor virusa v celico. Nekateri virusi, na primer virusi gripe, ebole in variacij SARS-CoV, potem vstopijo v vezikle, imenovane lizosomi, in tam izkoristijo gostitelja, da jih pomaga aktivirati. Pri virusu gripe pride do aktivacije zaradi povečanja kislosti, pri eboli in virusu SARS pa tako, da izkoristijo proteolitične encime gostitelja za aktivacijo virusnih proteinov, katere rezultat je zlitje virusne s celično membrano. Virus je torej celični zajedavec na najosnovnejšem molekularnem nivoju, ki si podredi metabolizem celice gostitelja, da začne proizvajati nove virusne delce, namesto da bi skrbela za lastno presnovo in obnovo. Ko je celica dovolj poškodovana, poči, virusni delci pa se sprostijo v okolico, kjer nato po že omenjenem mehanizmu okužijo še druge celice ali pa zapustijo organizem in se naselijo v naslednjem gostitelju.

Slika 1
Sliko je pripravila firma NEXU Science Communication

1. Velikost in struktura virusov

Virusi so mikroskopsko majhni delci, veliki od 20 do 60 nm, redko do 400 nm. Za primerjavo, najmanjša bakterijska celica je velika 400 nm, človeške celice pa so veliko večje in so v povprečju velike 100 um. To pomeni, da so virusi približno 250-5000-krat manjši od povprečno velike človeške celice in zato premajhni, da bi jih lahko opazili s svetlobnim mikroskopom. Za opazovanje in detekcijo virusnih delcev zato uporabljamo elektronske mikroskope. Prvi vpogled v atomarno strukturo molekul virusa smo dobili s strukturo rastlinskega virusa imenovanega »tobačni mozaični virus« na osnovi difrakcije rentgenskih žarkov (članek 1, članek 2). Ta virus je bil v 30-tih letih prejšnjega stoletja tudi prvi identificirani virus, ki je bil povzročitelj nalezljive bolezni, pa ni bil bakterija. Danes vemo, da je virusov vsaj desetkrat več od bakterij in so vsepovsod: v morju, vodi, zemlji, zraku ter napadajo vse vrste celičnih oblik življenja od najmanjših bakterij do vseh mnogo celičnih organizmov. Ob pojavu nove virusne bolezni COVID-19 v Wuhanu na Kitajskem si je precejšen del znanstvenikov po vsem svetu prizadeval, da bi čim prej pridobili znanje o strukturi in delovanju povzročitelja virusa imenovanega SARS-CoV-2. Leto po pojavu bolezni je objavljenih že več 1000 znanstvenih člankov, ki opisujejo virus, njegovo kužnost, epidemiologijo in poskuse zdravljenja.

Slika 2
Sliko je pripravila firma NEXU Science Communication

Genom SARS-CoV-2 je v približno 80% enak virusu SARS-CoV, ki je pred leti, prav tako na Kitajskem, povzročil epidemijo SARS, in je v 96% enak koronavirusu BatCoV RaTG13 iz netopirja, kar so ugotovili kitajski znanstveniki in objavili februarja letos v reviji Nature (članek 3). Zaradi tako velike podobnosti v genomih med obema virusoma so avtorji domnevali, da obstaja precejšna verjetnost, da je prišlo tudi do prenosa virusa SARS-CoV-2 iz netopirja na človeka. Po drugi strani pa 4-odstotna razlika v genomih tudi ni tako majhna – je večja od razlike med genomom človeka in šimpanza. Zato se zdaj razmišlja v smeri, da je bil za prenos mogoče potreben še en vmesni člen. Ta je verjetno malajski luskavec, pri katerem so našli raziskovalci corona virus, ki je še bolj podoben temu, ki ogroža ljudi (članek). Žal sta po objavi članka, ki navaja netopirje kot vir okužbe ljudi, človeška neumnost in nerazumevanje življenja povzročila uničevanja netopirjev. Upamo, da s to novo vestjo ne bo še bolj ogrožen luskavec (Manis javanica), ki je še bolj redka živalska vrsta. Avtorji tega članka objavljenega konec marca v reviji Nature pa predlagajo, da se luskavec umakne iz prodaje na tržnicah.

Koronavirus SARS-CoV-2 je okrogle oblike s premerom nekaj manj kot 50 nm oziroma do 200 nm (članek). Ilustracijo strukture Alissa Eckerta, ilustratorja medicinskih centrov združenih držav za kontrolo in preprečitve bolezni (U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC)) - (članek) uporabljajo mediji po vsem svetu. Pregledni članek avtorjev Schoemana in Fieldinga iz maja 2019 (članek) opisuje in analizira znanje o vlogi, strukturi in pomenu proteinov iz ovojnice virusov SARS. Koronavirusi so obdani s površinsko ovojnico, sestavljeno iz treh proteinov, imenovanih S (spike), E (envelope) in M (membrane). Vsi ti proteini vsebujejo transmembranske regije. Protein E naj bi bil ključen za ukrivljenost membrane, je pa sposoben oligomerizacije in lahko tvori dimere, trimere in pentamere – gre za oligomerizacijo, ki jo zasledimo pri ikozaedričnih virusih, vendar je za tvorbo delca poleg proteina E potreben vsaj še protein M. Oba proteina skupaj zadostujeta za tvorbo virusu podobnih delcev. Omenjena ilustracija tako zelo verjetno ne ustreza pravi strukturi, saj protein E s svojo 25 preostankov dolgo transmembransko regijo tvori oligomere, ki tvorijo pentamerne ionske kanalčke. Membrana pa je integralni del virusne ovojnice, vendar je od zunaj najbrž skrita pod proteinsko ovojnico teh dveh proteinov. Iz ovojnice štrleči »izrastki« proteina S vsebujejo receptor vezavno regijo, prek katere se virus veže na izbrane receptorje v membrani gostiteljske celice. Notranjost virusne kroglice izpolnjuje predvsem RNA, ki je virusni genom, in četrti strukturni protein N, ki pomaga pri zlaganju dolge verige RNA-ja. Oktobra 2020 pa je bil v reviji Cell objavljen članek znaslovom Molekularna arhitektura SARS-CoV-2 avtorjev Yao in sod. iz vrste raziskovalnih institucij iz Kitajske (grafični povzetek). Struktura je bila določena s krioelektronsko tomografijo kulture virusnih delcev. SARS-CoV-2 delci imajo premer med 70 in 100 nm in niso povsem okrogli (tomogrami in velikost delcev). V strukturi se vidi, da so S-proteini, imenovani tudi Receptor Binding Proteinie, neenakomerno razporejeni po površini, njihov različni nagib pa kaže na fleksibilnost (položaj S-proteina glede na površino membrane). V notranjost membrane s premerom cca 80nm se nahajajo ribonukleinski delci, ki vsebujejo genom virusa. V lumno virusa so našteli do 18,500 ribonukelinskih delcev (prerezov tomograma in slika jajčk v gnezdu), katerih številčnost zelo prispeva k uspešni replikaciji virusnih delcev v gostiteljevi celici.

2. Mehanizem vdora v celico

Virus SARS-CoV-2 vdre v celico tako, da prepozna receptor ACE-2 (angiotensin converting enzyme 2), ki je na površini človeških epitelijskih celic, predvsem v pljučih. Strukturo kompleksa med receptor vezavno domeno spike proteina RBD in receptorja ACE2 so določili kitajski znanstveniki pod vodstvom Qianga Zhouja s krio-elektronsko mikroskopijo in jo objavili 5. marca v reviji Science (članek). Strukturo tega istega kompleksa v kristalupa je objavila skupina Fang Li-ja iz ZDA konec marca v reviji Nature. Ameriški znanstveniki pod vodstvom Jasona McLellana objavili strukturo intaktnega spike proteina, preden se ta spoji s celičnim receptorjem (članek 9). Jason McLellan se je odzval na našo prošnjo in nam posredoval slikovni material, ki vključuje sliko modela virusa SARS/CoV-2 (sliki 1 in 2), njegovo vezavo na celico gostitelja (slika 3) in animacijo vezave virusa prek spike proteina na receptor celice ACE2 (film). Slike je pripravilo podjetje NEXU Science Communication, animacija pa je delo podjetja Elara. Ta dela so pokazala, da amino kislinski preostanki v stiku z receptorjem prilagodijo in s tem učvrstijo vezavo med molekulama. Z mutacijami so tudi preverili razlike med SARS-CoV in SARS-CoV-2 in pokazali na močnejšo vezavo novega virusa na ACE2. Raziskovalci so predlagali, posamezna molekula v dimeru molekul ACE2-ja veže dva para trimernega S proteina. Vpogled v 3D strukture S proteina in kompleksov in njihove primerjave z že prej znanimi strukturami tako odpira možnost za izboljšano načrtovanje antigenih determinant virusa in s tem priprave (boljših) cepiv.

Slika 3: Protein S (spike) specifično prepozna receptor ACE2 na človeških epitelijskih celicah
Sliko je naredila firma NEXU Science Communication.

3. Glavna virusna proteaza je potencialna tarča za zdravila

Pri AIDS-u se je virusna proteaza izkazala za uspešno tarčo za zdravila. Pred tremi desetletji je razvoj inhibitorjev te aspratatne proteaze na osnovi 3D atomarne strukture strukture proteina in kompleksov z inhibitorji prvič uspešno pripeljal do izdelave novega zdravila. Danes je poznavanje 3D strukture tarče predpogoj za razvoj novih zdravilnih učinkovin. Glavna proteaza virusa SARS-CoV-2 sodi med cisteinske proteazo (to pomeni, da ima v reaktivnem mestu preostanek cistein). Ključna je za procesiranje virusnih proteinov in s tem razmnoževanje virusa. Glede na obseg objavljenih člankov in spletnih povezav tukaj večine del ne navajamo. Profil substratne specifičnosti pa je določila skupina Marcina Draga iz Poljske v sodelovanju z raziskovalci iz Nemčije (preprint). 3D strukture te proteaze v kristalu je do danes določilo več raziskovalnih skupin oziroma konzorcijev iz Kitajske, Nemčije, Združenega kraljestva in Združenih držav. Izreden pomen 3D strukture glavne proteaze je izpostavila tudi Proteinska Banka Proteinov, kjer je trenutno deponirahin že preko 1400 struktur molekul virusa in komplksov. V teku je izvajanje presejalnih testov s stotinami struktur in tisočimi substanc v laboratoriju kot tudi v "in silico" svetu z računalniki. Skupina Rolfa Hilgenfelda iz Nemčije v sodelovanju z več skupinami iz Nemčije in Kitajske, ki je lani objavila članek v reviji Science o strukturi kompleksa in izboljšanih lastnosti inhibitorja (tako imenovane spojine vodnice). Konzorcij 30 institucij z DESY in Univerzo v Hamburgu kot vodilnima institucijama vključno z nami je pred kratkim v reviji Science (članek) objavil masovni presejalni test cca 6000 substanc v klinični uporabi ali testiranju usmerjene na MPro Iz te strukturne študije je izšlo 11 substanc, ki imajo potencial, da po kliničnem testiranju postanejo zdravilo za COVID-19.

4. Nova varianta virusa

S tem, ko se virus širi v populaciji, se povečuje število replikacij in hkrati z njimi se večajo možnosti za evolucijo virusa. Raznolikost virusa se spremlja s sekveniranjem genoma. Ob koncu decembra 2020 je vzbudila pozornost tako imenovana nova varianta, katere analizo so predstavili v poročilu (2020 12-01 Public Health Service UK). Nova varianta v nekaterih regijah izpodriva prejšnje, kar kaže na njeno večjo nalezljivost. Zaznamuje jo 23 mutacij, med njmi je 13 takih, ki povzročajo spremembo kodirajoče amino kisline in 4 delecije. Posebaj so izpostavili mutacije v RBD regiji (Receptor Binding Domain) S-proteina: N501Y mutacija je na področju interakcije z receptorjem ACE2, delecija 69-70 je velikokrat povezana s spremembami v RBD, P681H pa se nahaja v bližini ceptivenega mesta za furine, ki ima pomen pri procesiranju proteina. N501Y mutacija se nahaja v regiji na katero se najpogosteje vežejo tako imenovana neutralizacijska protitelesa kar posledično vodi do zmanjšanja učinkovitosti terapij s protitelesi, proizvedenimi iz krvne plazme obolelih in tudi detekcije virusa z antigenskimi testi. Pojavnost 69-70 delecije sovpada z neuspelimi poskusi detekcije S-gena v komercianih testih.

5. Mehanizmi obrambe pred virusom in metode zdravljenja

Seveda se tudi organizem brani pred vdori virusov. Verjetno sega zgodovina obrambe pred virusi v sam nastanek celičnih oblik življenja. Obrambni sistem človeka pred okužbami z virusi tako temelji na vrsti mehanizmov na več ravneh. Osnovna sta dva sklopa mehanizmov, ki temeljita na predstavitvi delčkov virusa (antigenih determinant) na površini celice. Mehanizem, ki temelji na predstavitvi peptidnih koščkov virusa prek molekul MHC razreda I, pove obrambnim celicam, da je ta celica okužena. Obrambne celice pa nato sprožijo mehanizem celične smrti in njene razgradnje ter s tem preprečijo širjenje virusa. Drugi mehanizem temelji na vnaprejšnji, naučeni prepoznavi površinskih segmentov (antigenih determinant) virusa.

Pri tem mehanizmu tako imenovane profesionalne antigen predstavitvene celice najprej virus »pojedo« in analizirajo sestavo virusa ter jo nato predstavijo na površini prek molekul MHC razreda II. Te so signal za druge imunske celice, imenovane limfociti T, ki se aktivirajo, pomnožujejo in delujejo na vrsto drugih imunskih celic, med drugim tudi na limfocite B. Te nato sintetizirajo protitelesa ali imunoglobuline. Ta protitelesa so označevalci, ki se pripnejo na tuje delce, kot je na primer virus, in s tem dajo znak celicam, kot so na primer makrofagi, da viruse razgradijo, še preden vdrejo v celice organizma. Protitelesa so izjemoma lahko tudi direktni zaviralci vnosa oziroma aktivacije virusnih delcev.

Tako kot virusi gripe imajo tudi koronavirusi genomski zapis v obliki RNA. Med evolucijo so celice razvile različne načine prepoznavanja in odziva na prisotnost tuje RNA v svoji notranjosti, kar spada med tako imenovano prirojeno imunost. Med te spadajo različni stresni odzivi celice in kratke RNA (mikro RNA, ciklične RNA …), ki sodelujejo pri prepoznavanju in razgradnji tuje RNA. V evolucijskem boju za prevlado so virusi razvili različne načine nevtralizacije prirojene imunosti. Pri koronavirusu pride do uporabe membran gostitelja za tvorbo centrov pomnoževanja dednega materiala tako imenovanih replikacijskih organel oziroma dvojno membranskih mešičkov. Predvideva se, vendar ni dokazano, da so celice razvile načine prepoznave teh mešičkov v nekaterih primerih. Za SARS-CoV-2 to ni znano. Poleg prostorske izolacije so virus RNA razvili še dodatne mehanizme in eden od takih je oblika kamuflaže, pri kateri ima njihova RNA na svojih koncih podobne strukture kot celična mRNA (imenovani 5' kapa in poliA rep). Torej poleg mehanizmov vnosa in adaptivne imunosti so tudi terapije za izboljšanje prirojene imunosti pomembna možnost boja proti virusni infekciji. Obramba pred virusnimi okužbami, ki jo je oziroma jo lahko razvijeta znanost in farmacevtska industrija, temelji na cepivih in zdravilnih učinkovinah oziroma zdravilih, nestrokovno povedano.

S cepljenjem dejansko okužimo organizem z delčki virusa, ki naučijo obrambni sistem prepoznati okužbo. Ti delčki so lahko tudi ohromljeni oziroma poškodovani virusi, njihov genetski material ali proteinske molekule, ki so na njegovi površini. Cepljenje s proteini aktivira mehanizem prezentacije prek drugega razreda molekul MHC, to je tako imenovani priučeni imunski odziv, ko s simulacijo okužbe prepričamo imunski sistem, da začne proizvodnjo B-celic (in s tem protiteles), ki lahko ostanejo v organizmu tudi zelo dolgo časa. V nekaterih primerih tudi vse življenje. Te se ob vnovični okužbi takoj aktivirajo in namnožijo ter nas tako lahko ščitijo pred nadaljnjimi okužbami, še preden se bolezen sploh lahko razvije. Cepljenje z RNA oziroma DNA predstavlja novo generacijo cepiv, ki in lahko poleg prezentacije z molekulami vzpodbudi tudi spominski mehanizme preko prezentacije prvega razreda molekul MHC. V ZDA upajo (firma Moderna), da bodo ravno na ta način uspeli izdelati uspešno cepivo, ki so ga že uporabili na prvih prostovoljcih. Ravno ta del validacije pa zahteva največ časa, tako da smo od uporabe cepiva lahko še daleč.

Mehanizmi delovanja protivirusnih zdravil so različni. Zdravila so usmerjena na preprečevanje vstopa virusa v celico ali pa na podvajanje genetskega materiala – transkripcijo. Pri okužbah z virusi HIV so tako uspešna zdravila, ki na primer inhibirajo delovanje virusne proteaze, in pa taka, ki inhibirajo virusno reverzno transkriptazo.

Za učinkovito terapijo se večinoma uporablja kombinacija različnih zdravil. Koronavirus se mora za vstop v celico aktivirati s proteoliznimi encimi. Namesto svojih uporabi kar par gostiteljskih. Najprej metalokarboksipeptidaza ACE2 in nato še serinska proteaza (članek) ali pa alternativno, kot drugi encim, tudi cisteinsko proteazo katepsin L (članek). Več predlaganih načinov terapije vključuje kombinacijo protivirusnih zdravil (remdesdivir, širokospektralno protivirusno eksperimentalno zdravilo) ali antibiotika (azitromicina) in antimalarika hidroksiklorokina, ki se uporablja tudi za zdravljenje revmatoidnega artritisa in sistemskega obolenja lupus erythematosus, pri čemer hidroksiklorokin dvigne pH v endosomih in lizosomih in s tem verjetno prepreči fuzijo s celico in na ta način tudi vstop virusa vanjo. Še dodatno pa na ta način prepreči delovanje lizosomalnih encimov in s tem morda tudi aktivacijo virusa.

Dokler virus ostaja na površju organizma (to je na koži), pa se lahko branimo tudi z uporaba detergentov kot je milo in nepolarnih topil kot je alkohol, ki raztapljajo fosfolipidno membrano in jo s tem poškodujejo. Na ta način se poškoduje strukturo virusne ovojnice. To vodi do izgube notranje vode in s tem do sesutja strukture virusnega delca.

V New England Journal of Medicine so v prispevku z naslovom "Visualizing Speech-Generated Oral Fluid Droplets with Laser Light Scattering" objavili demonstracijo raznosa kapljic iz ust med govorjenjem ob uporabi navadne maske in brez nje (povezava). Že uporaba maske iz blaga (washcloth) med govorjenjem je skoraj preprečila iznos kapljic, njihov domet med govorom pa se je zmanjšal iz 50 cm do 75 cm na vsega nekaj cm. Meritev je pokazala, da je imela glasnost govorjenja predvsem vpliv na število izdihnjenih delcev (iz zelo glasnih 350 na 230 med zmanjšano jakostjo), vendar ni imela niti približno ne tako dramatičnega učinka kot uporaba maske. Zanimivo je, med govorjenjem in kašljanjem naj ne bi bilo velikih razlik, nasprotno pa kihanje lahko požene delce tudi do 10 m daleč (povezava na prispevek is National Geographic).

6. Komentar k teorijam o laboratorijskem izvoru virusa

Že 17. marca je skupina ameriških raziskovalcev v reviji Nature Medicine objavila krajši članek, to je korespondenco, o izvoru virusa SARS-CoV-2. Kristian Andersen in sodelavci so v njem predstavili komparativno analizo genomskih podatkov. Ta analiza je po njihovem mnenju jasno pokazala, da SARS-CoV-2 ni namerno manipuliran virus nastal v raziskovalnem laboratoriju. Njihova analiza je pokazala, da aminokislinsko zaporedje S proteina v vezavni regiji na ACE2 receptor omogoča 20-krat povečano konstanto vezave v primerjavi z zaporedjem S proteina iz virusa SARS-CoV, vendar je pri tem preskoku prišlo do alternativne vezave. Ta konceptualna razlika v bistvu izključuje možnost človeške manipulacije. Poleg tega bi človeška manipulacija genoma pustila sledove v obliku podobnosti z izvornim genomom. Prevedeno v laični jezik, razlik med zaporedjem skoraj 30.000 nukleotidov dolgega genoma virusa SARS-CoV-2 in znanimi virusi je preveč, da bi jih lahko namenoma vnesel človek. Naj še dodamo, ker ni teoretične podlage na kateri bi lahko optimirali virus na infektivnost ljudi brez obsežnega eksperimenta na ljudeh, ostaja kot edina možna razlaga ta, da je SARS-CoV-2 lahko nastal samo z evolucijo v največjem laboratoriju na planetu, to je v naravi.

7. Opomba

Namen te strani je omogočiti laični javnosti vpogled v mehanizme delovanja SARS-CoV-2, kot jih razkriva znanost. Upamo, da bomo s tem prispevali k večjemu ozaveščanju javnosti o nevarnosti, ki smo ji vsi izpostavljeni, in o načinih zdravljenja, ki se nam obetajo. Vsebina tega besedila ni dokončna in jo bomo sproti dopolnjevali z novimi izsledki. Zadnje spremembe so bile vnešene 26. decembra 2020. Za morebitne napake se iskreno opravičujemo.