Motena glikozilacija pri amiotrofični lateralni sklerozi in frontotemporalni demenci, povezani s C9orf72
Oznaka in naziv projekta
J3-60057 Motena glikozilacija pri amiotrofični lateralni sklerozi in frontotemporalni demenci, povezani s C9orf72
J3-60057 Dysregulated glycosylation in C9orf72-associated amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia
Logotipi ARIS in drugih sofinancerjev
Projektna skupina
Vodja projekta: dr. Boris Rogelj
Sodelujoče raziskovalne organizacije: Povezava na SICRIS
Sestava projektne skupine: Povezava na SICRIS
Vsebinski opis projekta
Znanstveno ozadje
Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD) sta dva konca fenotipskega spektra težkih, neusmiljeno napredujočih in na koncu usodnih nevrodegenerativnih bolezni. Za obe bolezni ni zdravila. Patološke značilnosti večine (95 %) ALS in več kot 60 % primerov FTD so citoplazemska agregacija in jedrno odstranjevanje TDP-43. TDP-43-pozitivni citoplazemski vključki so prisotni tudi pri 57 % primerov Alzheimerjeve bolezni (AD), 20 % primerov demence z Lewyjevimi telesci in pri številnih drugih nevrodegenerativnih stanjih. Kot prvi smo odkrili z ALS-povezane mutacije v genih TDP-43 in FUS. To odkritje je vodilo do pomembnih sprememb v razumevanju teh bolezni ter razvoja novih modelov in tarč za zdravljenje. Mutacije v TDP-43 so redke tako pri ALS kot pri FTD. Zato je eno najpomembnejših vprašanj na tem področju, kaj je vodi v napačno lokalizacijo in agregacijo divjega tipa TDP-43? Odgovor se skriva v spremembah njegovega de novo izražanja, modifikacijah, lokalizaciji in/ali razgradnji. Te spremembe so večinoma sporadične, lahko pa so posledica bolezenskih mutacij v drugih genih. Glavna med njimi je mutacija GGGGCC ((G4C2)n), razširjene heksanukleotidne ponovitve (HRE) v C9orf72, ki še po neznanem mehanizmu vodi do proteinopatije TDP-43. Več skupin, vključno z našo, je mutacijo HRE v prvem intronu gena C9orf72 povezalo s 40 % dednih primerov ALS in 25 % dednih primerov FTD, zaradi česar je ta mutacija HRE najpomembnejši genetski vzrok ALS in FTD. V zadnjih desetih letih se je začelo pospešeno intenzivno preučevanje točnega mehanizma patogeneze, ki povezujejo mutacijo HRE z boleznijo. To je pripeljalo do odkritja novih nekanoničnih mehanizmov oziroma njihove podkrepitve v povezavi z boleznijo. Trenutno so predlagani trije mehanizmi patogeneze, kako ponovitve (G4C2)n povzročajo toksičnost in nevrodegeneracijo. Prvi je povezan s haploinsuficienco, ki je verjetno posledica nastanka kompleksnih sekundarnih struktur DNA v mutantnem alelu in ima za posledico zmanjšano raven transkripta in proteina C9orf72. Drugi se nanaša na toksičnost RNA, pri čemer lahko transkripti, ki vsebujejo smiselno (G4C2)n ali protismiselno (C4G2)n RNA, tvorijo jedrne RNA-skupke, za katera je znano, da vežejo in zajamejo RNA-vezavne proteine (RBP), kar posledično vpliva na posttranskripcijsko uravnavanje genov. Zadnji predlagani mehanizem se nanaša na s ponovitvami povezano ne-ATG prevajanje (RAN) iz smiselnih in protismiselnih heksanukleotidnih transkriptov, pri čemer lahko nastanejo toksični polipeptidi z dipeptidnimi ponovitvami (DPR). Čeprav so dokazi za vsako od predlaganih hipotez prepričljivi, so v mnogih primerih izvedenih na modelih s prekomerno ekspresijo toksične komponente nad fiziološko koncentracijo, zato še ni jasno, kateri od mehanizmov (ali njihova kombinacija) je dejansko odgovoren za bolezen. Raziskave na področju toksičnost RNA so se doslej osredotočale na interakcije smiselne RNA (G4C2)n, pri katerih je bila ugotovljena povezava z nekaterimi mehanizmi bolezni. Vendar so neuspehi nedavnih kliničnih preskušanj, pri katerih je bila za utišanje smiselne (G4C2)n RNA uporabljena tehnologija protismislenih oligonukleotidov (ASO), opozorili na potrebo po iskanju dodatnih tarč. Zelo malo je znanega o patomehanizmih protismiselne (C4G2)n RNA, čeprav je njeno izražanje bolje korelira s patologijo TDP-43. Poleg tega je pred kratkim izšel članek, v katerem opisujejo, da protismiselni oligonukleotidi (ASO), usmerjeni proti (C4G2)n (in ne proti smiselno ponavljajoči se RNA!) močno ublažijo disfunkcijo TDP-43 v človeških C9orf72 ALS/FTD nevronih, pridobljenih iz iPSC. Tudi mi smo pred kratkim objavili članek, da protismiselna (C4G2)n RNA skoraj izključno veže in inhibira fenilalanil-tRNA sintetazo (FARS) v citoplazmi, zaradi česar se zmanjša polnjenje tRNAPhe in posledično zmanjša izražanje določenih proteinov, bogatih s fenilalaninom (bogati s Phe). V tem predlogu predlagamo znižano N-glikozilacijo kot novo mehanistično kaskado, ki prispeva k razvoju teh usodnih bolezni. S podrobno analizo genske ontologije proteinov, bogatih s Phe, smo opazili močno povezavo z začetnimi procesi poti N-glikozilacije, ki potekajo v ER (glej predhodne rezultate). V pilotnih poskusih za ta predlog smo nato opazili s C9orf72 povezano zmanjšanje izražanja dveh s Phe bogatih članov poti N-glikozilacije in znatno zmanjšanje N-glikozilacije na površini limfoblastoidnih celičnih linij, pridobljenih iz bolnikov s C9orf72, v primerjavi s kontrolo. Opazili smo tudi majhno, vendar statistično pomembno zmanjšanje skupne glikozilacije proteinov v limfoblastoidih bolnikov s C9orf72, motoričnih nevronih, pridobljenih s C9orf72 iPSC, in možganskih lizatih iz mišjega modela C9orf72. Predlagana mehanistična kaskada je še bolj prepričljiva, saj je več publikacij močno nakazalo motnje drugih poti glikozilacije kot možen mehanizem bolezni pri nevrodegeneraciji, vključno z ALS in FTD. Z našo študijo bomo določili tudi terapevtski potencial ASO, usmerjene proti protismiselni (C4G2)n RNA.
Identifikacija problema
Za ALS in FTD (in večino drugih nevrodegenerativnih bolezni) še vedno ne obstaja učinkovito zdravljenje, zato je za opredelitev novih terapevtskih ciljev ključnega pomena razumevanje osnovnih mehanizmov. Prevajanje mRNA v proteine je končni korak pri izražanju genov in lahko poveča ali zmanjša raven proteinov za več redov. Različne bolezni so povezane s spremembami v delovanju translacijskega ustroja. Naša skupina je pravkar odkrila, da protismiselna (C4G2)n RNA iz mutacije C9orf72 povzroča motnje v globalni translaciji in vodi do zmanjšanja izražanja proteinov, bogatih s fenilalaninom. Na voljo imamo prepričljive pilotne podatke, ki kažejo, da je N-glikozilacija eden od pomembnih mehanizmov, ki ga ta nepravilnost translacije zmanjšuje. Zaradi vseh dokazov je potrebno poglobljeno raziskati mehanizme in pomen mehanistične kaskade v bolezni, da bi odgovorili na naslednja vprašanja: • zmanjšana N-glikozilacija; Ali je v membranski frakciji limfoblastoidov bolnikov in drugih bolnikovih celic manj proteinov, bogatih s Phe, vključno s proteini v poti N-glikozilacije? Ali je glikozilacija specifičnih glikoproteinov zmanjšana v celičnih linijah, pridobljenih od bolnikov? • pomembnost nepravilnosti v N-glikozilaciji za bolezen; Ali je zmanjšanje proteinov, bogatih s Phe, pomembno za zmanjšanje N-glikozilacije, opaženo v tkivih bolnikov, celičnih linijah in mišjem modelu? Ali je ta učinek povezan samo z mutacijo C9orf72 ali tudi drugimi mutacijami ALS/FTD ali sporadični primeri kažejo podobne translacijske nepravilnosti? • dokaz mehanistične kaskade; Ali utišanje FARSA in/ali dejavnikov N-glikozilacije vodi do podobne disregulacije N-glikozilacije, kot je opažena pri C9orf72? Ali znižanje regulacije N-glikozilacije povzroča patološke značilnosti? • terapevtski potencial; Ali lahko ASO, usmerjen proti protismiselni (C4G2)n RNA, rešijo zmanjšanje regulacije proteinov, bogatih s Phe, ki sodelujejo pri N-glikozilaciji? Ali prekomerna ekspresija reši motnje v regulaciji N-glikozilacije?
Cilj predlagane raziskave
Cilj predlaganega projekta je določiti, ali znižanje regulacije proteinov, bogatih s Phe, zaradi mutacije C9orf72 vodi do zmanjšane regulacije poti N-glikozilacije, ter razjasniti mehanizem, pomen v bolezni in terapevtski potencial te disregulacije. Da bi izpolnili zastavljeni cilj in odgovorili na zgoraj navedena vprašanja, smo določili naslednjih pet ciljev, ki so usklajeni s štirimi delovnimi paketi: 1) Določiti vpliv mutacije C9orf72 na izražanje dejavnikov N-glikozilacije in drugih z membrano povezanih proteinov, bogatih s Phe. 2) Določiti s C9orf72 povezane spremembe v N-glikozilaciji proteinov. 3) Določite pomen opaženih nepravilnosti v N-glikozilaciji v bolezen. 4) Opredelit mehanizme, ki vodijo do nepravilnosti pri N-glikozilaciji. 5) Ustvariti možnosti za terapevtske pristope na osnovi ASO za ublažitev opaženih nepravilnosti. V predlaganem projektu bodo uporabljene najsodobnejše metode (glikoproteomika, tehnologija ASO, mikroskopija visoke ločljivosti, modeli, pridobljeni z iPSC, itd.), da bi razširili razumevanje in bolezenske posledice nepravilnosti glikozilacije, ki jih posreduje protismiselne ponovitve RNA C9orf72 HRE. Strukturna in funkcionalna karakterizacija mehanistične kaskade bo vključevala konfokalno in superresolucijsko mikroskopijo, glikomiko in druge za oceno pomembnosti bolezni ter razvoj ASO in drugih novih terapevtskih strategij.
Izvirnost pričakovanih rezultatov
Vodja projekta in mednarodni sodelavci so vsi vodilni raziskovalci na svojih področjih. Pričakujemo, da bo projekt s prepričljivimi predhodnimi podatki zagotovil močnejšo podporo in boljše razumevanje mehanizma opaženih nepravilnosti glikozilacije, povezanih s fenotipi ALS in FTD, povezanimi s C9orf72. Osredotočili se bomo tudi na pospeševanje razvoja novih načinov zdravljenja ALS in FTD ter morda tudi drugih nevrodegenerativnih bolezni, povezanih s TDP-43. Poleg tega na podlagi naših dosedanjih dosežkov pričakujemo, da bodo rezultati, pridobljeni v okviru tega raziskovalnega projekta, zelo pomembni za naše področje in bodo verjetno dosegli objave z velikim vplivom.
Pomembnost in potencialni vpliv rezultatov
Nevrodegenerativne bolezni predstavljajo največjo grožnjo javnemu zdravju in gospodarstvu v razvitih državah. Kljub pol stoletja naprednih raziskav na področju nevroznanosti še vedno ni zdravila, ki bi lahko bistveno izboljšalo potek nevrodegenerativne bolezni. Demenca se kot glavni vzrok smrti celo kosa z boleznimi srca in rakom. Predvidevamo, da bodo ugotovitve tega projekta podobno kot uspeh in vpliv naših ugotovitev na področju genetike, patologije in interakcij z RNA omogočile vpogled v biologijo in patologijo ALS in FTD na molekularni ravni, kar bo omogočilo boljše modele bolezni in boljšo diagnostiko za preprečevanje in/ali zdravljenje teh smrtonosnih bolezni.
Osnovni podatki sofinanciranja so dostopni na spletni strani SICRIS.
Faze projekta in opis njihove realizacije
1. Faza
V prvem letu izvajanja projekta smo vzpostavili raziskovalni okvir za sistematično preučevanje povezave med mutacijo heksanukleotidnih ponovitev v genu C9orf72, zmanjšanim izražanjem fenilalanin-bogatih proteinov in motnjami v N-glikozilaciji kot potencialno pomembnim mehanizmom pri amiotrofični lateralni sklerozi (ALS) in frontotemporalni demenci (FTD). Projekt izhaja iz ugotovitve, da je protismiselna (C4G2)n RNA pomembno vključena v patogenezo C9orf72-povezanih ALS/FTD ter da njena interakcija s fenilalanil-tRNA sintetazo (FARS) vodi v zmanjšano aminoacilacijo tRNA^Phe in posledično v zmanjšano izražanje fenilalanin-bogatih proteinov. Na podlagi predhodnih rezultatov in bioinformatskih analiz smo kot eno ključnih nadaljnjih usmeritev opredelili raziskovanje vpliva teh sprememb na N-glikozilacijsko pot. V prvem letu dela smo se osredotočili predvsem na vzpostavitev eksperimentalnih in analitskih pristopov, potrebnih za izvedbo zastavljenih ciljev, ter na začetno validacijo delovne hipoteze. Posebna pozornost je bila namenjena analizi izražanja N-glikozilacijskih dejavnikov in drugih fenilalanin-bogatih membransko povezanih proteinov, saj je to ključno izhodišče za razumevanje, ali zmanjšana razpoložljivost vezane tRNA^Phe selektivno vpliva na proteinske skupine, pomembne za glikozilacijo in membransko biologijo. Vzporedno so bile izvedene pripravljalne aktivnosti za analizo sprememb v N-glikozilaciji proteinov, vključno z izbiro ustreznih modelnih sistemov, optimizacijo eksperimentalnih pogojev ter pripravo metod za nadaljnje vrednotenje glikozilacijskih nepravilnosti. Pomemben dosežek prvega leta je bila vsebinska in eksperimentalna nadgradnja predhodno objavljenih rezultatov o vplivu protismiselne (C4G2)n RNA na delovanje FARS in na izražanje fenilalanin-bogatih proteinov. V okviru projekta smo to izhodišče razširili v smer preučevanja posledic za N-glikozilacijsko pot, ki se je na podlagi analiz in preliminarnih rezultatov izkazala kot posebej relevantna. Pilotna opažanja, ki kažejo na zmanjšano N-glikozilacijo na površini C9orf72 limfoblastoidnih celičnih linij, dodatno podpirajo delovno hipotezo in potrjujejo smiselnost izbrane raziskovalne smeri.
2. Faza
3. Faza